纲目

胆固醇是细胞结构、功能和糊口才调的艰难分子，在癌细胞的发育、发展和糊口中起着至关艰难的作用。早期的商量标明，降胆固醇药物不错阻拦形态性死字配体1（PD-L1）的高抒发，这种高抒发有助于肿瘤细胞的免疫躲闪。然则，胆固醇对细胞名义PD-L1品貌的调控机制仍存在争议。在这里，咱们利用核磁共振和生化技能解释胆固醇不错通过两个胆固醇识别氨基酸共鸣（CRAC）基序平直与PD-L1的跨膜结构域鸠合，造成三明治状结构，并踏实PD-L1以防护下流降解。重要鸠合位点的突变阻拦了PD-L1-胆固醇相互作用，缩短了PD-L1的细胞品貌。咱们的商量完了揭示了一种专有的退换机制，不错规定PD-L1在癌细胞中的踏实性，为克服PD-L1介导的癌症免疫躲闪提供了另一种措施。

简介

胆固醇是质膜的主要因素，影响细胞膜的结构圆善性、厚度、通透性和流动性(1，2).算作几种激素的前体，胆固醇是退换细胞功能和信号传递的重要因素(三).胆固醇不错通过影响好多跨膜卵白的结构、功能和能源学来退换细胞功能(4，5).举例，胆固醇增强电压依赖性阴离子通说念（VDACs）的结构圆善性和激活，并影响VDACs与其他卵白质的相互作用(6).此外，胆固醇可督察G卵白偶联受体（GPCR）的踏实性或改变其功能(7–10)举例，胆固醇耗竭通过奋力配体鸠合来阻断趋化因子受体CXCR4的信号传导(11，12).胆固醇不错平直（通过胆固醇与卵白质鸠合）、障碍（通过膜特质的改变）或通过平直和障碍机制的鸠合来退换这些膜包埋卵白质的功能(5，9).在跨膜卵白中发现了三个促进胆固醇明锐功能的主要胆固醇鸠合基序，包括胆固醇识别氨基酸共有基序（CRAC，L/V-X）1–5个–Y/F–X1–5个–K/R）(13，14)，一个荒谬的胆固醇识别基序（CARC，K/R–X1–5个–Y/F–X1–5个–L/V）(15)以及胆固醇共鸣的主题(16).

最近，新的左证标明胆固醇在癌细胞中起着艰难作用(17).癌细胞的快速增殖和侵袭需要高水平的胆固醇(18).一些临床和实验商量标明，胆固醇在癌细胞中的蕴蓄会加多某些癌症的发病率(19)他汀类药物是缩短胆固醇的主要药物之一，对好多不同类型的癌症都有成心的完了(20).此外，肿瘤微环境中高胆固醇水平会影响肿瘤浸润免疫细胞的表型和活性(21，22)尽管胆固醇对免疫细胞的影响仍有争议。因此，退换胆固醇水平被以为是养息癌症和普及免疫养息完了的一种有出路的政策。

形态性死字配体-1（PD-L1），一种在癌细胞质膜上高抒发的卵白质(23)在他汀类药物养息后，抒发显著缩短(20)教唆PD-L1与胆固醇之间有密切关系。两个典型的CRAC基序（图S1）存在于PD-L1的跨膜结构域（TMD）中，标明胆固醇具有很强的平直鸠合后劲。然则，与胆固醇的相互作用是否会影响PD-L1的踏实性或功能尚未笃信。为了考据这一可能性，咱们商量了胆固醇对PD-L1的影响。着手，生化分析标明胆固醇普及了PD-L1的踏实性，利用核磁共振（NMR）波谱，咱们发现胆固醇不错平直与PD-L1的TMD中的两个CRAC基序鸠合。分子能源学（MD）模拟是一种强有劲的补充措施，揭示了PD-L1与胆固醇相互作用的细心结构和能量信息。功能突变进一步证实了CRAC基序在介导PD-L1的细胞品貌中起重要作用。咱们的商量完了为PD-L1与胆固醇的相互作用过头对肿瘤养息的影响提供了分子水平的主意。

完了胆固醇督察PD-L1的踏实性

为了商量胆固醇与PD-L1的关系，咱们着手通过免疫荧光染色和共定位分析探讨了东说念主结肠癌细胞系RKO细胞中PD-L1与胆固醇的空间关系，发现PD-L1和胆固醇与ImageJ笃信的Pearson有关统共为0.83有很强的有关性（图S2，a和B）(24).卵白合成阻拦剂环己酰亚胺（CHX）处理RKO细胞时(25)当加入胆固醇时，PD-L1的盘活速率较慢（图S2、C和D）。接下来，咱们检测了胆固醇、甲基β-环糊精（MCD）或辛伐他汀处理的RKO细胞中内源性PD-L1的抒发。MCD是一种水溶性团员物，不错奢侈细胞中的胆固醇(26)辛伐他汀是好意思国食物和药物治理局批准用于缩短总胆固醇的药物(27).westernblot分析标明，向RKO细胞中添加胆固醇，不错加多质膜中胆固醇的含量，上调PD-L1水平(图1A)而添加MCD或辛伐他汀可显耀缩短PD-L1的细胞品貌(图1、B和C).流式细胞术进一步证实了胆固醇、MCD和辛伐他汀对PD-L1细胞名义抒发的影响(图1D)共焦成像(图1E).长期如一地，在胆固醇养息后，PD-L1的细胞名义水平略有加多，但在通过MCD或辛伐他汀养息去除胆固醇后，PD-L1的细胞名义水平显耀缩短。此外，添加MCD或辛伐他汀后，内源性PD-L1的泛素化显耀加多（图S2、E和F）。总之，这些完了标明细胞胆固醇在PD-L1的定位和踏实性中起顾惜要作用。

图1胆固醇督察PD-L1的踏实性。

(A到C)用不同浓度的胆固醇（CHOL，0-50μM捏续12小时）、MCD（0-7.5 mM捏续6小时）或辛伐他汀（0-10μM捏续12小时）处理RKO细胞。Western blot检测PD-L1在每个养息中的抒发（top）。PD-L1抒发强度（相干于GAPDH）用ImageJ（底部）定量。所示数据为平均值±圭臬差(n=3）。P数值是用未配对的双面学生的t测试。(D和E)用流式细胞仪分析CHOL（25μM，12小时）、MCD（5 mM，6小时）或辛伐他汀（10μM，12小时）处理后细胞名义PD-L1的抒发。用FlowJo（E）定量测定PD-L1水平。抒发式数据露出为相干于对照组的折叠变化值，并表示平均值±圭臬差(n=3）。P数值汲取单因素方差分析策划。(F和G)免疫荧光染色露出，经CHOL（25μM捏续12小时）、MCD（5 mM捏续6小时）或辛伐他汀（10μM捏续12小时）处理的RKO细胞中存在PD-L1。用抗PD-L1抗体（绿色）标记PD-L1，用DAPI（蓝色）（F）染色细胞核。比例尺，10μm。荧光强度定量（G）；n=26、27、11和21，分辩用于对照组、胆固醇组、辛伐他汀组和MCD组。用单因素方差分析笃信统计学各异。扫数完了都代表了三个零丁的实验。

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咱们进一步用K562细胞（东说念主类长生化髓性白血病细胞系）考据了胆固醇对PD-L1抒发的影响。在K562细胞中，加入细胞因子IFN-γ（IFN-γ）后，PD-L1抒发上调(28).通过MCD或辛伐他汀缩短K562细胞中的胆固醇水平在IFN-γ存鄙人下调PD-L1（图S3A）。用当然杀伤细胞（NK）来源的上清液处理K562细胞也显线路同样的完了；在NK细胞上清液存在的情况下，对MCD或辛伐他汀养息的PD-L1水平缩短了约70%（图S3B）。在另一个实验中，咱们用IFN-γ对K562细胞进行预处理，并用抗PD-L1抗体标记细胞名义PD-L1。去除IFN-γ后，PD-L1水平着落了近50%，但在胆固醇存鄙人PD-L1的高抒发（图S3，C到E）。总之，体外实验完了标明，改变胆固醇含量止境退换PD-L1的细胞品貌。

PD-L1-TC的核磁共振表征

以上完了标明胆固醇在规定PD-L1水平中起着艰难作用。PD-L1的TMD中胆固醇识别基序（L255）-X-F257-XX-R260（CRAC1）和（L255）-XXX-F259-XX-R262（CRAC2）（图S1）的存在标明胆固醇有才调平直与PD-L1相互作用并普及卵白质踏实性，正如其他受体所报说念的那样。为了探索这种可能性，咱们着手用溶液核磁共振波谱分析了东说念主PD-L1与胆固醇之间的相互作用。PD-L1的跨膜/细胞质结构域（PD-L1-TC；氨基酸残基232至290）按照先前公布的决策进行抒发和纯化（图S4、a和B）(29).纯化的PD-L1-TC在两性离子1，2-二甲基糠酰中重组-序号-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）/1，2-二己基-序号-甘油-3-磷酸胆碱（DH6PC）双核（DMPC摩尔比：DH6个东说念主电脑，问=0.5）（图S4、C和D）。脊梁(图2A)通过一套基于横向弛豫优化光谱（TROSY）的圭臬三重共振实验笃信了PD-L1-TC的侧链（图S5A）共振分派(30).PD-L1-TC的二级结构是通过使用TALOS+形态分析主链化学位移得到的（图S5B）(31).终末的合奏(图2B)在15个最嚚猾量结构中[卵白质数据库（PDB）：7DCV]是使用240个卵白质核超滤效应（NOE）繁衍的距离料理（图S5C）和38个氢键料理（表S1）策划得出的，主链原子和重原子的均方根偏差（RMSD）分辩为0.619和1.194?。残基238～261造成了PD-L1-TC的螺旋区，其长度为38.6?(图2B).PD-L1的细胞质结构域很猛进程上是动态的，因为莫得具有二级结构特征的NOE信号（图S5C）。

图2双核中PD-L1-TC的NMR表征。

(A)二维1H，15DMPC/DH中PD-L1-TC样品的N-TROSY-HSQC谱6用bruker600mhz光谱仪纪录310k下的PC双核。百万分之几。(B)DMPC/DH中PD-L1-TC的15种最嚚猾量结构的动画阐述6PC双管。策划出的螺旋区域包含长度为38.6？的238到261个氨基酸（蓝色），被UniProt（右）瞻望的跨膜区域（氨基酸239到259，绿色）遮盖。(C和D)PD-L1-TC在DMPC/DH中膜浸没深度的测定6汲取水溶性探针Gd-DOTA。1H，15PD-L1-TC样品在穷乏（红色）和存在（玄色）15mm Gd-DOTA时的N-TROSY核磁共振谱；这两种光谱都是在310k下用bruker600mhz光谱仪（C）得到的。前期完了(我/我0)绘图了不同浓度Gd-DOTA（D）时N236和L248与[Gd-DOTA]的关系。我，在Gd-DOTA存鄙人的峰值强度；我0，无Gd-DOTA时的峰值强度。(E)DMPC/DH中PD-L1-TC的评价6亲水性Gd-DOTA和亲脂性16-DSA顺磁探针的前效应。16-DSA（2mm）和Gd-DOTA（15mm）引起的峰值强度缩短分辩以橙色和绿色条形图露出。在DMPC/DH中对PD-L1-TC进行了测量6在一个1H频率为700 MHz（pH 6.5）和310 K(F)由预作用笃信的PD-L1-TC的膜分派。PD-L1-TC结构的位置沿脂质双层膜的轴地方露出。跨膜区（氨基酸239至261）以灰色凸起露出，膜旁区（氨基酸262至272）以浅蓝色凸起露出，细胞质区域（氨基酸273至290）以粉红色凸起露出，残基236、251和261分辩为绿色、红色和紫色。从Gd-DOTA滴定圆善的前置放大图露出在右边。

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进一步用顺磁弛豫增强滴定法（PRE）评价包埋PD-L1-TC膜的构象(32).水溶性顺磁探针钆（III）1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸（Gd-DOTA）和亲脂性顺磁性探针16-羟基硬脂酸（16-DSA）分辩在DMPC/DH中滴定到PD-L1-TC6PC双管。纪录了一系列二维（2D）TROSY-异核单量子洽商（HSQC）光谱来笃信预效应(图2C).跟着Gd-DOTA浓度的加多，水相中残余物（如N236）的强度显著缩短，而埋藏在脂质双层（如L248）中的残余物强度着落的速率慢得多(图2D).这些完了与亲脂性16-DSA的补充前滴定一致(图2E)标明膜包埋残基为T239-L261，膜中心位于L251隔邻(图2F).

胆固醇与PD-L1-TC中CRAC基序鸠合

接下来，咱们在DMPC/DH中将胆固醇滴定为PD-L1-TC6通过二维TROSY-HSQC实验监测胆固醇引起的化学位移变化。在胆固醇浓度为0到2.5毫米的鸿沟内纪录核磁共振波谱。钯-L1-TC的胆固醇滴定导致核磁共振位置对一部分峰的实践性扰动(图3A).PD-L1-TC共振主要位于CRAC基序区，即F257、F259、R260和R262(图3、B和C).为了更精确地笃信胆固醇鸠合位点，两种自旋标记的胆固醇繁衍物，3β-DOXYL-5α-胆甾烷（DOXYL-CH）和25-DOXYL胆固醇（CNO）(33)，用于测定PD-L1-TC的前效应(图3D).DOXYL-CH在3β位置有一个氮氧化物部分，而CNO在围聚结尾甲基的位置25有一个氮氧化物。分辩用自旋标记的DOXYL-CH和CNO分辩滴定到PD-L1-TC样品中，用一系列2D-TROSY-HSQC光谱检测单个残基的强度变化(图3E).DOXYL-CH率领R260-R262残基产生横暴的PREs，标明胆固醇头部位于C端的膜旁区，而CNO则显耀缩短了G252-A254隔邻残基的强度(图3F)标明胆固醇尾鸠合在膜的中心。表不雅离解常数(Kd)利用预滴定数据进一步笃信的值在0.32～0.44mm鸿沟内，实验鸠合弧线与模拟弧线吻合较好n=2个(图3G) (34)这标明两个PD-L1鸠合位点在胆固醇鸠合方面具有正的协同作用。总的来说，前期数据标明胆固醇鸠合在从G252到R262的CRAC基序区域，因此头基群与细胞质室有关，酰基尾围聚膜中心。

图3PD-L1-TC中胆固醇鸠合位点的特征。

(A)相通2D1H，150.2 mM N-TROSY-HSQC光谱15N-标记PD-L1-TC在700mhz下得到(1在0毫米（红色）、0.5毫米（橙色）、1.0毫米（绿色）、1.5毫米（蓝色）、2.0毫米（紫色）或2.5毫米（玄色）胆固醇存在时，频率为310 K。(B)（A）图中四个区域的放大图，露出了两个CRAC基序（CRAC1:F257和R260；CRAC2:F259和R262）胆固醇滴定的特定化学位移扰动（右）。(C)DMPC/DH中添加1.5mm胆固醇后PD-L1-TC的NMR化学位移变化6PC双管。该图露出了PD-L1-TC在有或无胆固醇的情况下光谱之间的化学位移变化。(D)CNO（左）和DOXYL-CH（右）的化学结构露出在最上头的面板上。(E)前(我/我0)不同硝基标记胆固醇（DOXYL-CH和CNO）对DMPC/DH中PD-L1-TC的影响6PC双管。比增宽1H-15中间和底部面板分辩露出了2.4 mM CNO和DOXYL-CH的氮有关峰以及添加抗坏血酸后加宽峰的强度还原。(F)前(我/我0)CNO和DOXYL-CH的分析。添加2.4mm的CNO在L252～A254之间阐述出显著的预效应，而添加2.4mm的DOXYL-CH对R260～R262的预效应最为显耀。我，在顺磁性剂存鄙人的峰值强度；我0，在莫得顺磁性剂时的峰值强度。(G)DOXYL-CH（左）和CNO（右）引起的（1-PRE）与模拟鸠合弧线的比较。关于预数据，分辩用0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.4 mM DOXYL-CH和CNO滴定PD-L1-TC NMR样品。模拟的鸠合弧线n=1（无融合性，玄色虚线）和n=2（正配合度，红色虚线）分辩露出在各图中。

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胆固醇鸠合位点的分子能源学模拟评价

咱们进一步利用MD模拟评估胆固醇与PD-L1-TC的鸠合，这是商量卵白质-配体相互作用的一个有价值的器具。咱们着手使用AutoDock Vina 1.1.2将胆固醇在真空中固定到PD-L1-TC上(35)在上头形容的核磁共振料理下。利用PD-L1-TC的NMR结构（PDB:7DCV）算作分子对接的靶卵白。胆固醇在1-棕榈酰-2-油酰基中与PD-L1-TC对接-序号-用Desmond 2020软件构建甘油-3-磷酸胆碱（POPC）脂质双层环境(https://schrodinger.com/desmond，于2022年1月17日拜谒）。胆固醇领先定位在咱们的预分析笃信的位置；羟基端基分辩指向F257和R260，F259和R262，酰基链指向PD-L1-TC的跨膜中心(图4A).在对接历程中，5°胆固醇鸿沟内的PD-L1-TC侧链不错开脱转移。两个胆固醇分子在一个PD-L1-TC上的对接，与鸠合开脱能莫得空间碎裂?4.6kcal/mol，标明PD-L1与胆固醇的相互作用是热力学踏实的。咱们选定与咱们的核磁共振数据最接近的对接构象算作进一步分子能源学模拟的启动模子，以评估胆固醇与PD-L1-TC鸠合的踏实性。

图4核磁共振繁衍胆固醇鸠合位点的分子能源学模拟评估。

(A)模子露出胆固醇和PD-L1-TC在MD模拟轨迹上的位置（0纳秒，左至100纳秒，右）。CRAC1和CRAC2是PD-L1中与胆固醇相互作用的重要基序（绿色）。(B)细心形容了CRAC1和CRAC2在PD-L1-TC和胆固醇（绿色）上的相互作用。(C和D)鸠合热图露出胆固醇主要与PD-L1-TC中的CRAC1（C）和CRAC2（D）基序相互作用。橙色线露出胆固醇和PD-L1-TC之间的构兵次数。(E和F)热图强度的量化露出CRAC1和CRAC2基序的构兵数目。胆固醇主要通过与V253和F257的疏水相互作用以及与R260（E）的氢键和水桥与CRAC1基序相互作用。胆固醇主要通过与L255和F259的疏水相互作用以及与R262（F）的氢键和水桥与CRAC2基序相互作用。

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利用对接模子进行了三阶段MD仿真。前两个阶段是限制最小化和均衡运运用用默许的膜松懈契约在德斯蒙德。在达到均衡后，坐蓐干与第三阶段。在100 ns模拟之后，PD-L1-TC-胆固醇复合物中选定的原子的肇端位置和最终位置的RMSD图露出热拘谨（图S6），均方根涨落图露出卵白质骨干和配体原子在扫数这个词轨迹上保捏局部踏实（图S7）。模拟完了标明，CRAC1基序中的F257和R260以及CRAC2基序中的F259和R262不错与胆固醇鸠合(图4，B至E).相互作用分析标明，F257和F259通过疏水力与胆固醇相互作用，而R260和R262则通过氢键和水桥与胆固醇相互作用(图4，D和E).相对纯果然胆固醇酰基链通过疏水相互作用倾向于V253（CRAC1基序）或L255（CRAC2基序）。胆固醇与CARC1和CRAC2基序之间的鸠合能为?20和?分辩为18 kcal/mol，标明PD-L1和胆固醇对两个基序具有邃密的鸠合亲和力。

CRAC基序是PD-L1-TC与胆固醇相互作用的重要

为了考据核磁共振和分子能源学模拟笃信的对胆固醇鸠合至关艰难的特定残基，咱们使用丙氨酸扫描突变来替换两个CRAC基序中的每个残基。四个单突变体（PD-L1-TCF257A型，PD-L1-TCF259A型，PD-L1-TCR260A型和PD-L1-TCR262A型)用胆固醇滴定法检测。2D-TROSY光谱标明，在PD-L1-TC中加入了胆固醇F259A型和PD-L1-TCR262A型突变体引起的化学位移变化很少，在PD-L1-TC的核磁共振谱中只不雅察到轻细的化学位移扰动F257A型和PD-L1-TCR260A型添加胆固醇的突变体（图S8）。这些完了标明突变迫害了胆固醇与PD-L1-TC的鸠合。对其他突变体进行检测以检测PD-L1定位：东说念主胚肾（HEK）293FT踏实细胞抒发增强型绿色荧光卵白交融到PD-L1-TC分量，CRAC1基序双突变体（PD-L1-TCF257A/R260A)，CRAC2基序双突变体（PD-L1-TCF259A/R262A型)，以及一个双基序（CRAC1和CRAC2）四重突变体（PD-L1-TC）4米).在CRAC1和CRAC2单基序突变体中（PD-L1-TCF257A/R260A和PD-L1-TCF259A/R262A型)细胞名义PD-L1-TC水平与抒发野生型PD-L1-TC的细胞名义水平十分分量;双基序突变体PD-L1-TC4米在膜上未不雅察到（图S9）。这标明，当一个胆固醇鸠合位点被迫害时，PD-L1-TC不错督察平方的名义水平，但当两个胆固醇鸠合位点被迫害时，膜的结构圆善性就丧失了。

细胞实验进一步考据了CRAC基序与PD-L1踏实性的关系。全长野生型PD-L1（PD-L1分量)和PD-L1F257A型，PD-L1F259A型，PD-L1R260A型和PD-L1R262A型突变体在内源性PD-L1–敲除RKO细胞中单独抒发（图S10A），并使用Western blot分析PD-L1卵白的抒发。与PD-L1比较，扫数突变体的卵白抒发均显著缩短分量(图5A)而突变体和野生型的PD-l1mrna水平同样（图S10B）。与野生型比较，PD-L1的细胞名义抒发（通过流式细胞仪监测）也显线路四个单突变体的细胞名义抒发显著着落(图5B).CHX-chase实验标明PD-L1在四个突变体中降解速率更快(图5C).此外，与抒发野生型卵白的突变体比较，在MG132存鄙人检测到更高的泛素化水平(图5D).CRAC基序突变引起的PD-L1阻拦影响了PD-L1与形态性细胞死字卵白1（PD-1）的鸠合。当含有东说念主PD-1和免疫球卵白G（IgG）Fc片断的交融卵白(25)与抒发PD-L1的RKO细胞一皆培营养量流式细胞术露出突变体的平均荧光强度（MFI）显耀缩短。这标明CRAC突变体PD-L1膜抒发的缩短导致PD-1鸠合才调的显耀缩短(图5E).总的来说，这些完了标明CRAC基序关于PD-L1和胆固醇之间的相互作用以及PD-1与PD-L1的鸠合至关艰难。

图5CRAC基序是PD-L1与胆固醇相互作用的重要。

(A)外源性PD-L1的细胞水平分量，PD-L1F257A型，PD-L1F259A型，PD-L1R260A型和PD-L1R262A型在内源性PD-L1中，用Western blot分析RKO踏实细胞。(B)细胞膜PD-L1的流式细胞术分析分量，PD-L1F257A型，PD-L1F259A型，PD-L1R260A型和PD-L1R262A型在内源性PD-L1–敲除RKO踏实细胞中。条形图形容了相干于规定的折叠变化；所示数值为四个零丁实验的平均值±圭臬差(n=4）。用单因素方差分析笃信统计学各异。(C)CHX-chase法露出PD-L1降解分量还有变种东说念主。RKO踏实细胞抒发PD-L1分量，PD-L1F257A型，PD-L1F259A型，PD-L1R260A型和PD-L1R262A型用50μmCHX处理2、4、6或8小时，然后用Western blot检测PD-L1（如左图所示）。使用ImageJ分析（如右图所示）量化相对PD-L1卵白（剩余PD-L1）的强度。两个零丁的实验进行了同样的完了。(D)野生型PD-L1（PD-L1）泛素化水平分量)以及突变卵白PD-L1F257A型，PD-L1F259A型，PD-L1R260A型和PD-L1R262A型在HEK293FT电板中。用抗PD-L1抗体免疫千里淀后，用V5免疫踪迹法测定泛素化水平。两个零丁的实验进行了同样的完了。(E)流式细胞术检测PD-L1在RKO踏实细胞中的鸠合分量，PD-L1F257A型，PD-L1F259A型，PD-L1R260A型或PD-L1R262A型. The是的轴表示PD-1平均荧光强度（MFI）。数据露出为三个零丁实验的平均值±圭臬差(n=3）。用单因素方差分析笃信统计学各异。

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盘问

胆固醇在癌症的防守和养息中起着至关艰难的作用，因此在癌症商量中引起了越来越多的眷注。累积的左证标明胆固醇影响细胞膜卵白的结构、能源学和功能(36，37).尽管有好多胆固醇退换的例子，但由于胆固醇的体积小，能源学复杂，溶化性差，其潜在的机制一直是个谜。核磁共振波谱是一个通用的器具，时时用来填补在清爽脂类和膜卵白之间的相互作用的空缺。咱们过去应用核磁共振技能解释酸性磷脂通过劝诱膜旁区域的碱性残基和阻拦下流降解来退换PD-L1的踏实性(38).在这里，咱们提供了视觉和生化左证，胆固醇自身不错踏实细胞膜名义的PD-L1。咱们进一步证实胆固醇平直与PD-L1跨膜区鸠合，这在PD-L1的踏实性中起重要作用。东说念主PD-L1中有两个CRAC基序与胆固醇鸠合；突变的CRAC1或CRAC2基序迫害了PD-L1中胆固醇的鸠合，增强了PD-L1的降解。序列比对分析标明，东说念主的CRAC1基序在同源序列中并不保守；F257被缬氨酸或丙氨酸取代，R260被其他物种的半胱氨酸或酪氨酸取代（图S1）。违犯，CRAC2基序高度保守，苯丙氨酸残基通过π-π相互作用与胆固醇环鸠合，精氨酸或赖氨酸残基通过氢键与胆固醇的-OH基团鸠合。这标明鸠合一个胆固醇分子足以踏实大广博物种的质膜上的PD-L1。CRAC2基序可能是退换PD-L1跨物种踏实性的重要胆固醇鸠合基序，而独特的CRAC1胆固醇鸠合位点止境有助于东说念主类PD-L1的踏实。胆固醇与东说念主PD-L1鸠合的化学计量比可能不同于其他同系物。

时时，由于胆固醇在卵白质样品膜系统中的横暴分派，很难笃信胆固醇与膜卵白的化学计量比。PD-L1的小尺寸和高动态性进一步奋力了用x射线晶体学或低温电子显微镜测定有几许胆固醇分子与这种跨膜卵白鸠合。然则，咱们的核磁共振滴定数据标明PD-L1和胆固醇之间存在正的协同鸠合，PD-L1-TC不错与多个胆固醇分子鸠合(图3G).PD-L1与两个胆固醇分子的MD模拟也显线路细致的踏实性，CARC1和CRAC2对PD-L1和胆固醇的相互作用不错共存。这些完了标明，东说念主类PD-L1有可能在两个违犯的CRAC基序上同期鸠合两个胆固醇分子，造成三明治状结构(图6).PD-L1中两个胆固醇分子的专有设置在增强PD-L1的踏实性，从而使癌细胞躲闪免疫监视方面起着艰难作用。

图6形容胆固醇对PD-L1踏实性影响的表示图。

胆固醇不错平直与PD-L1的跨膜结构域鸠合，在细胞膜上踏实PD-L1。用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a（HMG-CoA）还原酶阻拦剂（辛伐他汀）或胆固醇奢侈试剂（MCD）缩短胆固醇水平，通过促进PD-L1泛素化和降解来缩短膜鸠合PD-L1的水平。CRAC基序的突变也有雷同的作用，缩短细胞名义的PD-L1水平。放大区域露出PD-L1-TC的两个胆固醇鸠合位点的重要残基（CRAC1:F257/R260；CRAC2:F259/R262）。

在稽查器中大开

咱们的商量完了进一步解释，突变CRAC基序迫害了PD-L1与胆固醇的相互作用，缩短了PD-L1的细胞水平(39)或溶酶体降解(25)棕榈酰更动酶DHHC3的棕榈酰化(40)但现在还不澄莹胆固醇对哪种阶梯有影响。咱们的数据露出PD-L1突变体加多了泛素化水平；胆固醇有可能踏实膜中的PD-L1，阻拦下流泛素依赖性降解。然则，咱们不可抹杀胆固醇可能增强膜鸠合PD-L1的棕榈酰化介导的踏实性的可能性。PD-L1细胞水平的缩短也可能是迫害PD-L1-胆固醇相互作用的多种阶梯的抽象完了，包括促进PD-L1降解和毁伤DHHC3棕榈酰化。还需要进一步的实验来商量胆固醇是否或如何影响这些阶梯。

林等等。最近报说念他汀类药物通过阻拦卵白激酶B（AKT）和β-catenin信号转导缩短癌细胞PD-L1的抒发(41).另一项商量露出辛伐他汀通过阻拦长的非编码RNA SNHG29的抒发来阻拦PD-L1的抒发，从而促进抗肿瘤免疫(42).两项商量均露出他汀类药物的障碍作用比单纯缩短癌细胞胆固醇更为复杂；违犯，它们会引起其他PD-L1有关因子活性的改变，而这些因子反过来又会下调PD-L1的抒发。比较之下，本商量揭示了胆固醇对PD-L1的平直作用。除了使用辛伐他汀算作降胆固醇药物外，咱们还用MCD处理细胞，以缩短细胞膜中的胆固醇水平；算作复兴，PD-L1的细胞水平缩短(图1、B和C).此外，当胆固醇加入RKO细胞时，PD-L1水平略有升高(图1A)当去除K562细胞中PD-L1抒发的刺激因子（IFN-γ）时，在胆固醇的存鄙人保捏踏实（图S3D）。总之，咱们的完了揭示了胆固醇在踏实癌细胞膜上PD-L1的专有作用。

抗PD-L1药物通过还原T细胞的杀伤活性，在养息多种癌症患者方面取得了广阔的临床到手(43，44).然则，现在基于PD-L1的癌症养息出现了一些问题，尤其是加多了患者的耐药性(45)，强调了替代抗肿瘤政策的必要性。据报说念，小分子阻拦剂可使患者致敏以达到养息完了(46).咱们不雅察到胆固醇不错平直与PD-L1鸠合并增强PD-L1在癌细胞中的抒发，这为开发小分子阻拦剂来回除或替代胆固醇、缩短PD-L1水缓和阻拦肿瘤滋长提供了专有的政策。假想或筛选胆固醇的竞争性化学雷同物可能是普及患者对免疫养息响应的补充政策。胆固醇在分子水平上平直参与PD-L1的退换，有望有助于抗癌养息的发展。

材料和措施试剂和电板

脂类和洗涤剂（DMPC、DH6从Avanti极性脂质（好意思国阿拉巴马州雪花石膏）中得到PC和25-羟甲基胆固醇。开脱基3β-DOXYL-5α-胆甾烷购自Sigma-Aldrich（好意思国密苏里州圣路易斯市）。核磁共振波谱实验的踏实同位素来自剑桥同位素实验室（好意思国马萨诸塞州特克斯伯里）。甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（10494-1-AP）和辣根过氧化物酶（HRP）鸠合的山羊抗鼠IgG（SA00001-1）从Proteintech（好意思国伊利诺伊州罗斯蒙特）得到。抗东说念主PD-L1抗体（ab213524），兔单克隆IgG（同型对照）（ab172730)山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab97051）购自英国剑桥Abcam。抗V5抗体（96025）和Alexa-Fluor 647-鸠合山羊抗东说念主IgG（A21445）从Thermo Fisher Scientific（好意思国马萨诸塞州沃尔瑟姆）得到。别藻毒素（APC）抗东说念主PD-L1抗体（329708）和APC小鼠IgG2b（同型对照）（400322）从BioLegend（加利福尼亚州圣地亚哥）得到。小鼠抗兔IgG（构象特异性）（5127S）、PD-L1胞外结构域特异性兔单克隆抗体（86744S）、Alexa-fluor488-鸠合山羊抗兔IgG（4412S）和Alexa-fluor647-鸠合山羊抗兔IgG（4414S）均来自细胞信号技能（Danvers，MA，USA）。重组东说念主PD-1fc嵌合卵白（1086-PD050）购自好意思国明尼苏达州明尼阿波利斯市研发系统公司。MG132、MCD、CHX和辛伐他汀从MedChem Express（好意思国新泽西州蒙茅斯要道）得到。胆固醇和其他生化试剂从Sigma-Aldrich购买。大肠杆菌DH5α（C2987I）和BL21（DE3）（C2527I）再行英格兰生物实验室（好意思国马萨诸塞州伊普斯维奇）购买。HEK293FT细胞系是孙立新[中国科学院分子细胞科学超卓中心（CEMCS）]的礼物。RKO细胞系是来自复旦大学（复旦大学）的礼物。其他细胞系均来自中国科学院细胞库。

野生型和突变型PD-L1-TC的抒发与纯化

东说念主PD-L1的TC结构域（残基232-290），定名为PD-L1-TC，由GenScript（好意思国新泽西州皮斯卡塔韦）合成。抒发式构造是通过交融PD-L1-TC在pMM-LR6载体（哈佛医学院S.C.Blacklow的礼物）中，将His9 TrpLE抒发序列的C结尾片断，在PC-L1-TC和His9-TrpLE之间添加蛋氨酸，用于溴化氰（CNBr）的裂解。利用圭臬团员酶链响应（PCR）技能生成突变体结构，并通过DNA测序进行说明。用于核磁共振样品制备，震动E、 大肠杆菌BL21（DE3）细胞在M9最小培养基中滋长，培养基中添加了Centrum成体复合维生素和踏实同位素。培养物在37℃下滋长到600 nm（OD）的光密度600)0.6至0.8，然后冷却至18°C，然后用250μM异丙基β进行率领-d-在18°C下过夜。关于十足氘化的卵白质，细菌培养在99.8

• 通过
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